Tiosbio^® Blunt Zero Vector预先偶联TOPO酶，加入PCR扩增产物后可迅速完成连接反应。载体借助自杀基因的表达与否筛选阳性克隆，连接阳性率高，自连背景接近于零。适用于高保真DNA聚合酶扩增后的平端PCR产物连接，载体带有氨苄青霉素和卡那霉素抗性筛选标记，及PstⅠ和NotⅠ酶切位点。如与带“A”尾的PCR产物连接应选择Tiosbio^® Simple TA Vector（Cat.No. TD0101）。

该载体连接反应时间可短至5min；操作简单，仅需加入载体和插入片段；无需蓝白斑筛选，阳性率高；载体带有可用于体外转录的T3 Promoter和T7 Promoter。

测序引物：

正向测序引物M13F(-47)：5΄- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3΄；

反向测序引物M13R(-48)：5΄- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3΄。

载体图谱：

• 问题1：平板克隆数少或不长斑

原因：通常是由于感受态效价较低造成，更换感受态可改善或解决该问题。含有卡那霉素的平板通常长斑数少于含有氨苄青霉素抗生素的平板，平板制作时加入100μg/mL氨苄青霉素抗生素，筛选效果更佳。

• 问题2：阳性率低

原因：连接PCR产物有引物二聚体、连接产物条带不明亮（浓度不够）、连接Taq PCR产物时通常阳性率低于80％

• 问题3：鉴定插入片段大小与预期不符

原因：回收过程中PCR产物发生断裂，形成小片段产物，尤其是大片段回收、连接时尤为严重。菌检产物大小为200bp＋目标产物长度，如插入片段为500bp，则菌检阳性克隆应为700bp。