Tiosbio^® 2×SYBR Green I qPCR Mix（with ROX）是基于SYBR Green I嵌合荧光法进行Real-Time PCR的专用试剂，该预混液包括化学修饰的热启动DNA聚合酶、反应Buffer、dNTPs、SYBR Green I、ROX染料等试剂，试验时仅需加入引物、模板、水。预混液中添加的化学法修饰的Hot Start DNA聚合酶在50℃以下无活性，95℃加热10~15min后方可完全恢复酶活，从而有效地抑制非特异性PCR扩增，极大提高了PCR扩增的特异性。预混液的反应缓冲液经反复优化，可最大程度确保qPCR的扩增效率、检测灵敏性和信号强度；添加的ROX荧光染料矫正反应孔间的信号，适用于Low ROX矫正的Real-Time PCR仪，如ABI PRISM7000/ 7700/7900HT，7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR，Stratagene的 Mx 3000P等仪器。

1. 单组分预混液，使用方便；
2. 高特异性，可有效抑制非特异性扩增；
3. 高灵敏性，有效检测低表达丰度基因。

TR0201-1为1mL，用量为100次（20μL/次）；TR0201-1为5mL，用量为500次（20μL/次）。

-20℃避光保存有效期为12个月；-70℃避光保存有效期为36个月；长期-20℃保存融化后可能会出现沉淀，只需室温融化后混合均匀即可。

1.无CT值（信号）出现

①检查热启动时间是否为15min；②引物降解，使用新合成的扩增引物；③模板量不足，加大初始模板添加量。

2.CT值出现过晚

①扩增效率低，优化反应条件，重新设计扩增引物；经过温度梯度确定适宜的退火温度，PCR反应程序更改为下表中的三步法；PCR产物最佳扩增区间为100~400bp。

3.标准曲线的线性关系不佳

①存在加样误差；②标准品降解，重新制备并稀释标准品；③不适宜的引物浓度，在50~500 nM之间优化引物的终浓度。

问题4：融解曲线不止一个主峰

解决方法：

（1） 将延伸温度从60℃提高至65℃；

（2）引物浓度不佳，适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比；

（3）模板有基因组的污染，RNA提取过程中应避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增；

（4）重新设计新的引物。

问题5：出现引物二聚体

解决方法：

（1）尽管使用最为严谨的化学修饰法热启动DNA聚合酶，由于引物设计不佳或模板结构复杂，有时引物二聚体不可避免。此时可将循环数降低到30~35。除此外，可使用去离子甲酰胺溶解引物（20μM）以减少引物自身的二级结构，并降低引物工作浓度；

（2）如引物二聚体Ct至低于样品7个以上，引物二聚体对结果的可靠性干扰将低于1%，通常不影响实验结果。